блокировка экрана
градиент

Иммуноферментный анализ — от скрининга на HbsAg до комплексной диагностики

anti hbs это

С внедрением в медицину современных технологий растут возможности иммунохимических методов диагностики, которые способны быстро и точно распознать заболевание, когда другие методы бессильны. Понимание того, что вирус гепатита В способен находится в организме в очень невысокой концентрации, при которой он не может быть обнаружен даже таким надежным методом, как ПЦР, заставляет по-новому взглянуть на проблему диагностики этого заболевания и по достоинству оценить возможности иммуноферментного анализа.

В этом материале мы подробно разберем все, что касается этого вида лабораторных исследований. Вы узнаете, что представляет собой иммуноферментный анализ и как он проводится, что такое австралийский антиген и как он определяется, что означают непонятные сокращения Hbs ag, Hbcor, at и какова их роль в расшифровке анализа, а также получите еще много полезной и интересной информации.



ВИЧ у детей

Содержание статьи:

  1. Общая информация об иммуноферментном анализе
  2. Антигены вируса гепатита В: Hbs, Hbe и Hbc
  3. Антитела к антигенам вируса гепатита B
  4. Практическое применение знаний об антигенах и антителах

 

Общая информация об иммуноферментном анализе

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА) — метод лабораторной диагностики, с помощью которого можно обнаружить как антигены, так и антитела самых различных инфекций, включая гепатит В. Современные знания свойств вируса и особенностей иммунного ответа организма, позволяют не только обнаружить инфекцию, но и определить ее стадию, эффективность вакцинации и оценить эффективность лечения.

Суть иммуноферментного анализа

В основе ИФА лежит реакция «антиген — антитело», а точнее ее свойства.

В ответ на вторжение чужеродного вещества (антигена), которым в частности являются белки вируса, организм вырабатывает защитные белки — антитела. Антитела вступают в сложную реакцию с антигеном, блокируя его активность.

Подробнее об антигенах и антителах мы поговорим ниже, сейчас же отметим, что к каждому антигену образуются строго индивидуальные, или как говорят врачи — гомологичные антитела. Таким образом, если мы хотим выявить определенный антиген в крови, то будем использовать диагностический планшет с антителами к нему. Если антиген в крови есть, то он вступит в реакцию с антителами, что можно будет обнаружить различными способами. И наоборот. Если мы хотим найти какие-либо антитела, то нам понадобится планшет с соответствующим антигеном.

Чаще всего диагностическую ценность несут как раз антитела, с помощью которых можно диагностировать практически любую инфекцию. Однако особенность вируса гепатита Б заключается в том, что главную роль в диагностике играет один из антигенов — австралийский антиген.

Как проводится ИФА

полностью лечится ли гепатит с
Чем интенсивнее окрашивается раствор во время проведения ИФА, тем больше антител содержится в ячейках планшета

Рассмотрим типичную процедуру ИФА на конкретном примере, когда требуется выявить антитела к возбудителю.

Для диагностики используется планшет с 96 лунками, которые заранее пропитаны соответствующим антигеном. Далее процедура выглядит следующим образом:

  • во все ячейки наносится сыворотка крови;

  • гомологичные антитела вступают в реакцию с антигеном и прицепляются к планшету;

  • планшет промывают, удаляя неприкрепившиеся антитела;

  • далее в ячейки вносят ферментативную метку — вещество, которое вступая в реакцию с антителами, вызывает окрашивание содержимого ячейки.

Такова стандартная процедура ИФА с окрашиванием, которая применяется, например, в иммунохроматографических тест-полосках.

ИФА не ограничивается качественным определением антител или антигенов возбудителя. Чем больше антител содержится в ячейках планшета, тем интенсивнее окрашивается раствор. Сравнивая его оптическую плотность с контрольной, современная аппаратура может достаточно точно посчитать концентрацию антител в единице объема. Таким образом, осуществляется количественный ИФА, мерой измерения при котором чаще всего являются единицы оптической плотности (ЕОП).

Иммунохемилюминесцентный анализ

Сегодня существует несколько десятков разновидностей ИФА, каждая из которых имеет предпочтительную область применения. Наибольшей популярностью при диагностике гепатита В пользуется иммунохемилюминесцентный анализ.

Ферментативной меткой при этом анализе служат не хроматины, как в стандартной ИФА, а особые вещества — люминофоры, которые вызывают свечение комплекса в ультрафиолетовом свете.

С помощью специального прибора — люминометра, можно с высокой точностью определить уровень свечения и, как следствие, концентрацию искомого вещества.

Методами ИФА определяют почти все существующие антигены вируса гепатита B и антитела к ним.

Антигены вируса гепатита В: Hbs, Hbe и Hbc

Термин антиген (antigen) происходит от двух английских слов: antibody — антитело и generator — производитель. Таким образом под антигеном понимают любое вещество, которое вызывает образование в организме антител к нему. Чаще всего антигенами являются белковые соединения.

На сегодняшний день известно о трех антигенах вируса гепатита В: hbsag, hbc и hbe.

Австралийский антиген

Белок, который входит в состав внешней оболочки возбудителя гепатита В был обнаружен еще задолго до открытия самого вируса. Такое название антиген получил, потому что впервые был выявлен у коренных обитателей Австралии. Впрочем, на первых порах белок считался не антигеном, а вполне обычным элементом крови у туземцев, а осознание его связи с болезнями печени пришло несколько позже.

гепатит безжелтушная форма
Длительное сохранение антигена в крови и отсутствие антител указывает на возможность формирования HBеAg-позитивного хронического гепатита В

Сегодня в профессиональной литературе название «австралийский антиген» практически не встречается и его вытеснила международная аббревиатура — HbsAg (hepatitis b surface antigen — поверхностный антиген гепатита В). Кроме того, можно встретить и сокращенные обозначения hbs антиген или просто hbs. Любое из этих сокращений приемлемо и может быть дополнено записью ВГВ или HBV — вирус гепатита B (hepatitis b virus).

Поверхностный антиген вируса гепатита B имеет одну примечательную особенность, которая делает его незаменимым диагностическим маркером — его концентрация в крови может достигать очень высоких показателей, вплоть до полумиллиграмма в миллилитре крови. Так происходит потому, что только небольшая часть новых HBsAg, которые образуются при размножении вируса гепатита В, идут на построение оболочек новых вирусных частиц, а остальные — свободно циркулируют в крови. В результате количество частиц hbs в крови может превышать число вирионов в сотни тысяч раз.

Эта особенность делает австралийский антиген основным маркером в скриннинговой диагностике гепатита В, который обнаруживается в крови уже через 4-6 недель после заражения. По мере формирования антител, поверхностный антиген постепенно замещается ими. Если спустя 6 месяцев HBsAg сохраняется, то это говорит о переходе инфекции в хроническую форму.

С недавних пор, когда появилась возможность определять концентрацию hbs hbv, его роль в диагностике еще более выросла, поскольку опираясь на уровень антигена можно отличить хронический гепатит В (ХГВ) от здорового носительства, а также мониторить эффективность лечения.

Антигены сердцевины

В сердцевине вируса — нуклеокапсиде — располагаются белки, которые контролируют процессы размножения вируса HBcoreAg и HBeAg.

HBcoreAg, который может называться также HBcorе-антиген, hbc или сердцевинный антиген, может быть обнаружен только в тканях печени, непосредственно в ядрах гепатоцитов. Этот антиген не обнаруживается в крови и диагностического значения не имеет.

ифа hbsag
Строение вируса гепатита

HBeAg (HBe, HBprecoreAg) — напротив, играет важную роль в диагностике. HBeAg и HBcoreAg — близкие родственники. Они обладают большим сходством строения и отличаются в основном пространственным положением молекул. В отличии от HBcore, HBe не входит в состав стенки нуклеокапсида, и свободно циркулирует в крови.

Роль HBe в инфекционном процессе еще недостаточно ясна, однако особенности его поведения и их связь с течением инфекционного процесса уже достаточно изучены. HBeAg указывает на активное размножение вируса и позволяет достоверно определить фазу хронического течения ХГВ — HBeAg-позитивную или HBeAg-негативную.

HBe можно обнаружить в крови уже в инкубационном периоде острого гепатита ВБ(ОГВ), при этом высокая концентрация HBeAg в течение 3 неделю с большой вероятностью говорит об угрозе хронизации процесса. Концентрация HBe напрямую связана с содержанием частиц Дейна (так называются вирусные частицы гепатита В) — чем выше количество HBe, тем выше концентрация ДНК HBV в крови.

HBeAg — главный маркер инфекционности заболевания. Кровь HBeAg-позитивных пациентов намного заразнее, чем HBeAg-негативных. Например, у беременных женщины положительных по HBe и Hbs вероятность передать инфекцию ребенку достигает 50%, тогда как вероятность такого события у HBe-отрицательных, но Hbs положительных матерей составляет 10-30%.

Hbe определяет течение хронического гепатита. HBеAg-позитивный хронический гепатит В имеет гораздо более неблагоприятный прогноз в плане развития цирроза печени.

Вот, пожалуй, и все, что необходимо знать об антигенах ВГВ, и мы переходим ко второй группе маркеров гепатита Б — антителам.

Антитела к антигенам вируса гепатита B

Антитела (анти-,antibody, anti-, at) — это особые белки, которые вырабатывает наш организм, чтобы защититься от антигенов. Химически они представляют собой сложные белки, которые обладают возможностью распознавать и связываться с антигеном и участвуют в его нейтрализации или уничтожении. Другое наиболее антител — иммуноглобулины (Ig).

В настоящее время известно 5 классов антител человека:

если есть антитела к гепатиту б
Компьютерная модель антитела IgG
  • IgG — основной иммуноглобулин в крови здорового человека, доля которого составляет до 75% от всех антител. Это единственный класс Ig, который может проникнуть через плаценту и защитить плод.

  • IgМ — антитела, которые появляются при первом контакте B-лимфоцитов с незнакомым антигеном и участвуют в дальнейшем его распознавании. Доля этих иммуноглобулинов составляет около 10%.

  • IgA составляет 15-20 % от всего числа антител и участвует в защите слизистых дыхательной системы желудочно-кишечного тракта и мочеполовых путей.

  • IgD содержится на поверхности некоторых В-лимфоцитов. Доля этих антител не превышает 1%, а функции еще полностью не ясны.

  • IgE осуществляет защиту от паразитарных инфекций и обуславливает многие аллергические реакции. В свободном виде в крови практически не определяется.

Уточнение класса антител требуется только для HBcoreAg, а в остальных случаях учитываются все иммуноглобулины — суммарные антитела.

Антитела к HbsAg

Антитела к поверхностному антигену (анти-HBs, antiHbsAg, HbsAb, at HBs) обнаруживаются обычно у тех, кто уже перенес гепатит В или у вакцинированных. Они обладают защитными свойствами, предотвращая повторное заболевание.

Anti-Hbs начинают вырабатываться достаточно быстро — на 4-12 неделе. Однако, поскольку они сразу вступают в реакцию с австралийским антигеном, концентрация которого, как вы помните, очень высока, анти-HbsAg обнаружить не удается. Когда содержание антигена и антитела выравнивается, в крови не определяется ни HbsAg, ни at hbs. Это называется фазой серологического окна, которое длится от недели до 3-4 месяцев, после чего антиген в крови полностью заменяется на антитела — происходит сероконверсия по hbs, что является надежным показателем выздоровления и формирования постинфекционного иммунитета. Уровень антител нарастает медленно и достигает максимального значения через полгода-год. Анти-hbs долго циркулируют в крови, иногда — пожизненно.

Однако так происходит не всегда. Раннее появление анти-hbsag является грозным признаком тяжелого фульминантного гепатита, а при хроническом гепатите В hbsag и антитела к нему иногда могут определяться параллельно.



доктор

Определение концентрации антител к HbsAg помогает оценить эффективность вакцинации




Определение концентрации anti-hbs помогает оценить эффективность вакцинации. Для обеспечения надежной защиты требуется концентрация антител не ниже 10 мМЕ/л. Если этот показатель снижается, то желательно провести ревакцинацию.

Антитела к HBeAg

кровь на hbsag что это
Длительное сохранение антигена в крови и отсутствие антител указывает на возможность формирования HBеAg-позитивного хронического гепатита В

Анти-HBeAg (HBeAb) можно определить после исчезновения HBe-антигена в крови больного, где они обнаруживаются еще на протяжении от полугода до 5 лет после перенесенной инфекции. Обычно антитела появляются на 8-16-й неделе после заражения, что говорит о завершении острого периода инфекции.

При нормальном течении острого гепатита, происходит постепенная сероконверсия по hbe, что является благоприятным прогностическим признаком. При этом необходимо помнить, что существуют мутантные формы HBV, в которых нарушено образование HBeAg, вследствие чего, не смотря на высокий уровень антител, вирус активно размножается, и формируется HBeAg-негативный ХГВ с высокой активностью. Распознать такое течение можно, если оценивать ИФА в комплексе с ПЦР, которая покажет высокое содержание ДНК вируса.

Длительное сохранение антигена в крови и отсутствие антител указывает на возможность формирования HBеAg-позитивного хронического гепатита В, а низкое содержание анти-HBе с исчезновением HBе — HBеAg-негативного ХГВ.

Таким образом, анти-HbeAg — важный прогностический маркер течения болезни.

Антитела к сердцевинному антигену

Иммуноглобулины к Hbcore в отличие от самого антигена определяются в крови и используются в лабораторной диагностике. При использовании крови на анти-Hbcor (анти-HbcoreAg, анти-HbcAg или просто анти-Hbc) определяют как суммарное содержание антител, так и содержание анти-Hbc IgM и анти-Hbc IgG.

Иммуноглобулины класса М обнаруживают в крови уже в инкубационном периоде острого гепатита еще до изменения биохимических показателей. Они циркулируют в крови 6-12 месяцев, после чего исчезают. Таким образом, анти-Hbc IgM — надежный маркер ОГВ. Однако ориентироваться только на этот показатель нельзя, поскольку IgM может выявляться во время обострения хронического гепатита В.

Анти-HbcAg IgG появляются вместе с IgM и сохраняются в крови пожизненно, и их главная ценность заключается в том, что иногда они являются единственным признаком латентной формы гепатита В, который не определяется другими серологическими маркерами и методом ПЦР.



доктор

Главная ценность анти-HbcAg заключается в том, что иногда они являются единственным признаком латентной формы гепатита В




Эта особенность IgG нашла свое применение при обследовании донорской крови в Германии, США и некоторых других странах совместно с Hbsag, что делает ее более безопасной. В России такая практика пока не нашла всеобщего применения, поскольку тестирование на IgG удорожает процедуру и грозит отбраковкой до 20% крови.

Практическое применение знаний об антигенах и антителах

Все антигены ВГВ, за исключением Hbcore и антитела к ним, являются маркерами различных стадий инфекции и широко применяются в диагностике. Надежным методом их определения является иммунохемилюминесцентный анализ, который отличается высокой точностью и не требует специальной подготовки. Перед проведением всех перечисленных ниже анализов все, что необходимо сделать человеку — это не курить за 30 минут до процедуры

Анализ на Hbsag

Анализ на поверхностный антиген вируса гепатита B назначается для следующих целей:

  • скрининговая диагностика гепатита Б;
  • уточнение фазы заболевания;
  • мониторинг течения ХГВ;
  • контроль донорской крови;
  • контроль эффективности вакцины.

В норме при исследовании крови HBsAg не определяется. Обнаружение антигена свидетельствует об остром или хроническом гепатите. Отрицательный результат анализа крови на австралийский антиген возможен в период серологического окна и при латентной инфекции, поэтому при подозрении на заболевание необходим комплексный анализ маркеров.

Исследование на HBе-антиген

антиген гепатита б это

Анализ на HВeAg не используется самостоятельно и всегда оценивается в комплексе с остальными маркерами.

Основные задачи исследования:

  • мониторинг течения ОГВ;
  • определение опасности больного для окружающих;
  • оценка эффективности лечения.

Референсные значения качественного анализа на HBе-антиген — «отрицательно», количественного — отношение S/CO (signal/cutoff): 0 — 1. При этом signal/cutoff — соотношение оптической плотности исследуемого раствора к контрольному образцу, а референсное значение — среднее значение, которое получают при обследовании здорового населения.

Положительный тест наблюдается при остром и хроническом гепатите В с активным размножением вируса.

Отрицательный результат отмечается в начале ОГВ, при низкой активности процесса репликации и при выздоровлении.

При интерпретации анализа необходимо учитывать, что вирус может мутировать и больной остается заразным в период сероконверсии по HВе. Кроме того некоторые штаммы вируса вообще не образуют HВeAg, что особенно характерно для жителей Азии.

Анализ на суммарные антитела австралийскому антигену

Количественный анализ на HBsAb определяет общую концентрацию этих антител без разделения их по классам. Основные цели, которые преследует анализ:

  • мониторинг ХГВ вместе с другими маркерами;

  • оценка постинфекционного иммунитета;

  • отбор кандидатов для прививки в группах риска и определение показаний к введению иммуноглобулина.

Референсное значение анализа крови на антитела к Hbs антигену — «отрицательно» или 0 — 10 мМЕ/мл.

Положительный результат анализа на антитела к HBsAg говорит о перенесенном гепатите В, если при этом в анализах не определяется поверхностный антиген, или свидетельствует об эффективной работе вакцины.

Отрицательный результат может говорить об отсутствие вирусного гепатита В, если это подтверждают другие маркеры, а также указывает на отсутствие постпрививочного иммунитета. Кроме того, антитела не определяются в активной фазе заболевания.

Необходимо помнить, что возможен ложноположительный результат анализа у лиц, которым ранее переливалась кровь или ее компоненты.

Положительный анализ на анти-Hbs Ag не является на 100% достоверным признаком выздоровления от ВГВ, учитывая существование разных подтипов вируса. Теоретически есть вероятность того, что в крови циркулирует anti-Hbsag одного типа, а заражение происходит вирусом гепатита В другого. У таких пациентов австралийский антиген и HBsAb могут быть обнаружены одновременно.

Исследование на антитела к HBе-антигену

Появление Anti-HBe (HBeAb, анти-HBeAg) обычно носит положительный прогностический характер. С возникновением сероконверсии кровь больного становится менее заразной в разы. При хроническом гепатите В возможна обратная сероконверсия — антитела исчезают, а титр HBe повышается.

Основные цели исследования:

  • мониторинг течения ВГВ;
  • определение стадии заболевания;
  • оценка эффективности ПВТ.

Референсное значение анализа на HbeAb — «отрицательно» или S/CO>1.

Положительный результат анализа говорит о завершении острого периода инфекции, HBeAg-негативном ХГВ, а о выздоровлении, если в крови определяются HBsab и anti-HBcore.

Отрицательный результат анализа отмечается в инкубационном периоде и острой фазе болезни, HBeAg-позитивном ХГВ и просто при отсутствии вируса в организме.

При интерпретации анализа нужно помнить, что вследствие мутации вируса, возможно сохранение заразности биологических материалов больного даже при положительном тесте на anti-HВe.

 Анализ на антитела класса IgM к HBcoreAg

гепатит б анализы расшифровка
Компьютерная модель антитела IgM

Anti-HBc IgM появляются в период активного размножения вируса и исчезают после выздоровления. Отсутствие IgM при наличии австралийского антигена — верный признак хронического течения ВГВ. Появление IgM при диагностированном ХГВ указывает на его обострение.

Основные задачи анализа:

  • диагностика острого гепатита В;
  • дифдиагностика гепатитов;
  • контроль за течением ХГВ.

Референсное значение анализа на anti-Hbcor IgM — «отрицательно» или 0 — 9,99 Ед/мл.

Положительный тест свидетельствует об ОГВ при наличии HBsAg или обострении ХГВ. Отрицательный результат возможен, если вирус в организме отсутствует, в период инкубации ОГВ, а также в период выздоровления или перехода в хроническую форму.

Отрицательный тест на anti-HBc IgM, который наблюдается при наличии симптомов и лабораторных данных за заболевание печени, требует поиска других причин патологии. Примерно в каждом десятом случае выработка IgM немного задерживается, поэтому в сомнительных случаях анализ необходимо сдать повторно через 2 недели.

Анализ на суммарные антитела к ядерному антигену HBV

Самостоятельный анализ на IgG к HBcAg проводится редко. Гораздо чаще применяется общее определение всех антител к HBcAb (anti-HBc, anti-HBcore). Anti-HBcore подтверждают, что человек контактировал с вирусом, даже если прочие маркеры не определяются. У детей до 1.5 лет определяются материнские антитела к ядерному антигену, если матерью инфекция была перенесена ранее.

ифа гепатит б

Основные задачи анализа:

  • выявления ВГВ;
  • дифдиагностика гепатитов;
  • обнаружение ранее перенесенного ВГВ;
  • уточнение стадии инфекционного процесса.

Референсное значение анализа на HBcAb — «отрицательно» или S/СO: 0 — 0,85.

Положительный тест на антитела к Hbcor может говорить об остром гепатите В присутствии HBsAg, ХГВ при наличии HBsAg и отсутствии IgM, ранее перенесенной инфекции.

Отрицательный результат возможен, если вирус в организме отсутствует и в период инкубации.

Самостоятельное исследование на anti-HBcore не поможет точно определить, болен ли человек, и оценку анализа необходимо проводить с учетом других лабораторных данных.

Перечисленные анализы назначаются в разных сочетаниях, что может быть обусловлено целью анализов, возможностями лечебного учреждения, оснащением лаборатории и другими причинами. Так или иначе, исследование должно быть комплексным и не должно оставлять сомнений в правильности диагноза.

О прогнозе на жизнь, если все-таки наличие вируса подтверждено, можно прочитать в статье «Как и сколько живут люди с гепатитом Б».

В заключении статьи приводим диагностическую табличку, которая позволяет определить стадию и характер инфекционного процесса, опираясь на маркеры ВГВ.


Комплексная оценка маркеров ВГВ

* Начальная стадия ХГВ, которая характеризуется интенсивным размножением вируса.